不动样品、不动物镜，也能快速三维成像：AUROX Clarity 与远程聚焦记录活体神经钙信号_AUROX资料、文章及解读_应用与文献

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导语

研究活体神经活动时，研究者希望同时满足三件事：看到三维、看得快、又不能对样品施加太多光照或机械扰动。传统共聚焦逐点扫描，速度受限；靠移动物镜或载物台来换焦面，又会让样品晃动。

英国埃克塞特大学 Alexander Corbett 团队 2020 年在 Biomedical Optics Express 发表的论文，把 AUROX Clarity 转盘共聚焦与“远程聚焦”（remote focusing）光路组合，搭建了 SD-RF 显微镜。在不移动样品和成像物镜的情况下，系统以每秒 1 个体积的速度对 Platynereis 幼虫的神经系统做多层成像，记录到了自发钙信号。作者在致谢中写明，所用的 Clarity 由 Aurox Ltd 出借，并声明不存在利益冲突。

什么是远程聚焦

远程聚焦的思路是：用第二个匹配的物镜在样品之外重建一个忠实的三维“像”，然后在这个像的空间里移动一个轻小的透镜来选择焦面。这样，换焦面时样品和成像物镜都不用动；只要光瞳平面之间的映射关系做得准确，离焦成像时产生的像差（主要是球差）可以相互抵消。

系统怎么搭建

Gintoli 2020 Figure 1 — 图 1　SD-RF 显微镜光路示意。转盘（SD，即 Clarity）产生的结构化照明经远程聚焦单元成像到样品上；荧光由 O1（40× 0.8 NA 水浸物镜）收集，经 O2 缩像、O3 再成像回转盘。焦面内的荧光进入相机一半，焦外成分进入另一半，实时处理后得到共聚焦图像。O3 由压电器件驱动，决定样品中的成像深度。来源：原文 Figure 1。

系统由三部分组成：

显微镜主体：Olympus IX73 倒置显微镜，配 40× 0.8 NA 水浸物镜。
远程聚焦单元：两只 Olympus 40× 0.95 NA 空气物镜“鼻对鼻”放置，其中一只装在 PI 压电驱动器（PIFOC）上，用来快速换焦面。
转盘：Clarity（Aurox Ltd），由 CoolLED pE-300 LED 阵列照明。作者介绍，盘上刻有反射式二值光栅，并有三种不同空间频率，可在“高信号、弱切片”和“低信号、强切片”之间选择，另有“旁路”档用于宽场成像。焦面荧光穿过光栅、焦外荧光被反射，两路像分别落在 Andor Zyla 4.2 sCMOS 相机的两半，经加权相减得到高对比度的光学切片图像。

相机、LED、压电驱动由 Micro-Manager 控制。为减少光漂白，LED 只在相机曝光期间点亮。

研究发现

1. 成像体积内畸变小。作者用飞秒激光在低折射率（n = 1.34，接近水）聚合物中刻写了三维荧光标定样品。测量显示，在 400 µm 的轴向范围内，放大率变化小于 3%。

2. 分辨率在较大深度范围内保持稳定。

Gintoli 2020 Figure 4 — 图 2　不同远程聚焦深度下测得的横向 (a) 和轴向 (b) 分辨率（FWHM）。橙点为仅远程聚焦（宽场），蓝点为 SD-RF（加转盘），灰色实线为在显微镜侧口直接测得的参考值，粉色条为活体成像所用的深度范围。来源：原文 Figure 4。

用分散在琼脂糖中的 100 nm 荧光微球测量，在 130 µm 的轴向范围内，横向分辨率优于 490 nm，轴向分辨率优于 5 µm。超过约 200 µm 后测量结果波动较大，作者将其归因于远程聚焦单元中一块大二向色镜变形引入的像散。

3. 活体多层钙成像。

Gintoli 2020 Figure 6 — 图 3　表达 GCaMP6s 的 Platynereis 幼虫前部神经系统，5 个焦面中的 4 个，层间距 6 µm，覆盖 24 µm 深度；单帧曝光 50 ms，帧率 5 Hz。比例尺 50 µm。来源：原文 Figure 6。

研究对象是表达钙指示剂 GCaMP6s 的 Platynereis dumerilii（一种海洋环节动物，常用于神经发育研究）幼虫。作者在幼虫前部神经丛设置了 5 个焦面，层间距 6 µm，从表面以下约 15 µm 延伸到约 40 µm。每帧曝光 50 ms，帧率 5 Hz，即每个深度每秒采样一次（1 体积/秒），连续记录 10 秒。每一层都能分辨细胞体。

Gintoli 2020 Figure 7 — 图 4　(a) 在 Z = 128 µm 焦面上划定的 3 个感兴趣区；(b) 4 个焦面上各区域荧光相对变化（ΔF/F）随时间的曲线，叠加数字为各时间点的 ΔF/F 值。来源：原文 Figure 7。

在多个焦面的感兴趣区中，可以看到与神经活动相关的钙信号变化。作者报告，静息期曲线的 ΔF/F 标准差小于 0.03，信噪比大于 10，因此不需要对多次事件做平均就能识别单次活动。

4. 多通道三维成像。LED 光源通过电动滤光块切换激发和发射波段。由于切换一次可能需要约 500 ms，作者建议在相邻两个体积之间换色，而不是逐帧换色。他们在固定的幼虫样品上演示了 DAPI、pERK、乙酰化微管蛋白、神经肽等多色三维成像（原文 Figure 8）。

作者推测与讨论

作者认为，与常规转盘系统相比，SD-RF 的速度优势主要体现在轴向范围较大的情况，因为此时移动载物台所占的时间比例较高。
他们提出，如果在压电器件扫过整个范围的同时曝光，可以得到扩展景深图像；但对神经组织这类细胞密集的厚样品，这样做会把多层信号叠加在一起，掩盖荧光变化，因此并不适合。
作者估算，在转速 3000 rpm、轴向 FWHM 4 µm 的条件下，理论上可支持更高的帧率，但这属于推算，论文中没有相应的实验数据。

局限

作者在讨论中较为坦率地列出了限制分辨率的因素：

所用水浸物镜没有盖玻片校正，而活体和固定样品都需要盖玻片，因此引入了明显的球差。作者用单独的测试样品证实，盖玻片会使 PSF 明显拉长，并使对焦位置偏移约 28 µm。
远程聚焦单元中 3 mm 厚的二向色镜可能变形，带来像散，在 Z > 200 µm 时尤为明显。
中继透镜的焦距理论上应为 135 mm，实际选用了相近规格的现货 140 mm，存在放大率失配。
体积速率受压电器件“移动—停稳—曝光”节奏的限制；多色成像需要在体积之间换色，活体样品移动可能导致通道间错位。
这是一套实验室自建系统，并非商品化配置；论文展示的是方法可行性，生物学结论有限。

与 AUROX 产品的相关性

这项工作直接使用商品化的 AUROX Clarity 模块作为光学切片“引擎”，用到了它的三档条纹盘、宽场旁路、LED 照明，以及“透射像 + 反射像”同时成像的特点。论文说明了两点：其一，Clarity 可以作为相对独立的模块接入非标准光路，与远程聚焦等自建光学组合；其二，LED 照明配合曝光同步开关，可以在活体钙成像中控制光照总量。

产品要点：Clarity 通过标准 C 接口安装，带标准 C 接口的显微镜（包括正置机型）理论上都可以加装，覆盖 Leica、Nikon、Olympus/Evident、Zeiss 等品牌，具体型号请提前联系欧浩，与厂家确认。Clarity 标准版最高 50 fps，HS 版最高 100 fps；除 LED 外，也可以通过扩束器接入激光作为面光源；软件可选 AUROX Visionary 或 Visitron VisiView（VisiView 支持 Clarity）。如需开展神经或电生理相关的活体成像，欢迎与我们讨论具体的显微镜和物镜配置。

原文信息

题名：Spinning disk-remote focusing microscopy
作者：Gintoli M, Mohanan S, Salter P, Williams E, Beard JD, Jekely G, Corbett AD
期刊：Biomedical Optics Express，2020，11(6): 2874
DOI：10.1364/BOE.389904
许可：CC BY 4.0（文中图片引自原文，版权归原作者所有。原文 Figure 5(b) 含改编自其他文献的示意图，本文未使用）
原始数据：University of Exeter 数据仓库，https://doi.org/10.24378/exe.2343

本文为对原文的解读，非作者官方译文。

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邮箱：lili@ohhktech.com
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