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导语
在厚样品深处做荧光成像时，常见的问题是越往里图像越“糊”。原因之一是像差（aberration）：样品内部各处折射率不同，浸油、盖玻片和组织之间也存在折射率差异，光波穿过后波前发生扭曲，焦点不再是一个清晰的小点。天文望远镜用“自适应光学”（adaptive optics，AO）来抵消大气扰动，显微镜也可以借用同样的思路。
2022 年发表在 Journal of Microscopy 上的一项研究中，牛津大学工程科学系 Martin Booth 团队联合牛津大学生物化学系和日本大阪大学，把一套基于可变形镜的 AO 模块接入 AUROX Clarity 免激光转盘共聚焦光路，并为这种成像方式设计了专门的图像质量指标。作者在论文中指出，此前这类无传感器 AO 尚未在“相关盘”（correlation disk）型显微镜上实现过。
研究背景：Clarity 是怎样得到光学切片的
Clarity 的成像原理与常见的针孔阵列转盘不同。作者在文中做了说明：LED 光照到刻有平行条纹的旋转盘上，一部分光被条纹反射掉，另一部分穿过条纹，在样品焦面上形成条纹状照明；焦面以外的照明则是均匀的。样品发出的荧光再成像回盘面，焦面附近的信号主要穿过条纹（透射像 I_T），焦外的模糊光主要被盘面反射（反射像 I_R）。两路像同时落在同一台相机的上下两半，相减就得到光学切片图像，相加则得到普通宽场图像。
盘上有三种不同间距的条纹，对应低、中、高三档切片强度。作者引用厂家参数：三档的光学切片厚度分别约为 2.5 µm、1.7 µm 和 0.9 µm。条纹越细，切片越薄，但信号也越弱，这与点扫描共聚焦中调节针孔大小的取舍类似。
作者分析，像差会同时作用于照明和检测两条光路：照到样品里的条纹变模糊，透射像和反射像之间的差别变小，切片图像的信号和分辨率（尤其轴向）都会下降。
研究方法：插入可变形镜，优化“中频”信息
正常使用时，Clarity 直接装在显微镜侧口。为了插入 AO，作者把模块与 Olympus IX71 机身分开，中间加了一段 1:1 的 4f 中继光路，把可变形镜放在与物镜光瞳共轭的平面上。其余配置包括：Olympus 60×/1.4 NA 油镜、PI 压电 Z 台、Photometrics Prime BSI sCMOS 相机，以及 CoolLED pE-300ultra LED 光源。
“无传感器”指不用专门的波前传感器测量像差，而是采用逐个试探的办法：对某一种像差模式（用 Zernike 多项式描述，如像散、彗差、球差），让可变形镜依次施加几种不同幅度的预设像差，各拍一张图，计算图像质量指标，再用高斯函数拟合出指标峰值的位置，作为该模式的校正量。逐个模式重复，即完成一轮校正。
这项工作的关键在于质量指标的设计。作者的分析是：Clarity 的成像依赖条纹图案在样品中被准确地“投射”和“再成像”，而盘面条纹的空间频率位于光学传递函数通带的中段。低频信息几乎不受像差影响，高频信息又容易被噪声淹没，因此他们设计了一个加权掩模，放大中高频段的功率，并滤除噪声水平以下的成分。指标直接在相机的原始图像（同时包含透射像和反射像）上计算，不需要先做切片重建。
研究校正了 5 种低阶像差：两种像散、两种彗差和一阶球差。作者报告，一轮校正约需 11 秒。
研究发现
1. 三档切片模式下都能校正。
在果蝇三龄幼虫神经肌肉接头（NMJ）样品中，校正前三档模式的图像对比度和分辨率都较差；校正后突触结（bouton）的轮廓和细节明显清晰。不同档位亮度不同，作者解释为切片越薄，层内包含的荧光标记越少。之后的实验都采用对像差更敏感的高切片档。
2. 不同深度都有改善。
在 10、13.5 和 26 µm 三个深度，校正后的图像对比度和分辨率都有提升。作者也如实指出，越深信号越弱，即使校正后也是如此，可能与标记密度、残余像差以及组织吸收和散射有关。
3. 多通道 Z-stack 中能看清更多细节。
作者在 Z-stack 中心做一次校正，然后采集 200 个 Z 位置。校正后，神经和突触的结构更清楚，单个圆形的突触后致密区可以分辨，而未校正图像中这些结构是模糊的。在果蝇卵室样品（36 µm Z-stack）中，校正后环管（ring canal）呈现出环状结构，而未校正时看起来像实心（原文 Figure 6）。
作者在一个通道（466 nm 激发）上完成校正，再用于其他通道，理由是样品折射率结构引起的像差对不同波长基本一致。
作者推测与展望
作者认为，这套 AO 方法应可推广到其他成像应用，从而扩展这类显微镜在深层组织成像中的能力；他们也提到，多轮校正在某些情况下可能带来进一步改善，校正耗时也有优化空间。这些属于作者的展望，论文中没有给出对应的实验数据。
局限
论文展示的均为固定样品（BPAE 细胞、果蝇 NMJ、果蝇卵室），没有活体或活细胞的动态实验。
改善效果主要通过图像对比和质量指标曲线（原文 Figure 8）呈现，正文没有给出分辨率或信噪比提升的具体倍数。
只做了一轮校正，并且在单一位置、单一通道校正后用于整个 Z-stack 和其他通道；对于像差随位置变化明显的样品，效果可能不同。
AO 模块是实验室自建的光路，并非 Clarity 的标准配置；普通用户要复现，需要相应的光学搭建能力。
利益声明：通讯作者 Martin Booth 声明与 Aurox Ltd 存在重大利益关系，致谢中也感谢了 Aurox 员工的技术帮助。读者应结合这一背景理解结论。
与 AUROX 产品的相关性
这项研究使用的是商品化的 AUROX Clarity 转盘共聚焦模块，用到了它的三档切片、宽场与共聚焦同时输出、LED 照明等特点。对 Clarity 用户来说，论文的意义在于两点：一是 Clarity 的光路可以与可变形镜等研究级光学部件组合，适合有方法学开发需求的光学实验室；二是论文对 Clarity 成像原理和像差影响的分析，可以帮助用户理解厚样品深处信号下降的原因。
产品要点：Clarity 通过标准 C 接口安装，带标准 C 接口的显微镜（包括正置机型）理论上都可以加装，覆盖 Leica、Nikon、Olympus/Evident、Zeiss 等品牌，具体型号请提前联系欧浩，与厂家确认适配方案。Clarity 标准版最高 50 fps，HS 版最高 100 fps；除 LED 外，也可以通过扩束器接入激光作为面光源；软件可选 AUROX Visionary 或 Visitron VisiView（VisiView 支持 Clarity）。
原文信息
题名：Wavefront-sensorless adaptive optics with a laser-free spinning disk confocal microscope
作者：Hussain SA, Kubo T, Hall N, Gala D, Hampson K, Parton R, Phillips MA, Wincott M, Fujita K, Davis I, Dobbie I, Booth MJ
期刊：Journal of Microscopy，2022，288(2): 106–116（2020 年 11 月在线发表）
DOI：10.1111/jmi.12976
许可：CC BY 4.0（文中图片引自原文，版权归原作者所有。原文 Figure 1 为“经 Aurox Ltd 许可修改，版权归 Aurox Ltd”，本文未使用该图）
本文为对原文的解读，非作者官方译文。
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