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文献来源（学术 RIM 方法扩展；INSCOPER 同步出现在方法中）

Mangeat, T., Mazzella, L., Rogez, B., Giroussens, G., Li, X., Bernard, M., Vargas, P., Allain, M., Labouesse, S., Idier, J., LeGoff, L., Sentenac, A. Super-resolved live imaging of thick biological samples with 3D Random Illumination Microscopy (3D-RIM). bioRxiv preprint (2025).

DOI：https://doi.org/10.1101/2025.08.06.668879

图片使用说明：文中插图来自该预印本（bioRxiv，作者/资助方持有版权；页面与 PDF 标注为 Creative Commons CC BY-NC-ND 4.0），未作内容改动；转载时保留作者、预印本平台与 DOI。该许可为非商业、禁止演绎，若用于商业站点发布请自行核对合规性。预印本未经同行评审。

导语

厚组织、胚胎和类器官的三维超分辨，一直卡在两件事上：样品引起的像差与散射会破坏结构化照明图案；焦外荧光又会把对比度“冲掉”。法国图卢兹 CBI（LITC）与马赛 Institut Fresnel 等团队合作，在 随机照明显微术（Random Illumination Microscopy, RIM） 框架上提出 三维随机照明显微术（3D-RIM）：用散斑照明、探测臂远程聚焦、三维光子重分配与三维方差匹配，在薄样品上达到约 110 nm（横向）/ 270 nm（轴向）的分辨率，并在数十微米乃至数百微米深度的组织中保持较高对比度。需要强调：本文是学术方法预印本，不是商业 liveDRIM 整机评测。

研究背景：为什么厚样本里“图案照明”会失效

常规宽场对焦外背景敏感；共聚焦、周期性结构光照明显微术（structured illumination microscopy, SIM）与光片等方法则依赖照明图案的完整性——样品越厚，激发侧的散射与像差越明显，分辨率随深度下降。RIM 用一系列随机散斑（speckle）照明，从多幅图像的方差重建超分辨结构，不必精确知道每一张散斑的形状，因此对激发侧像差相对鲁棒。此前 2D-RIM 已在活细胞等场景展示约两倍于宽场的横向分辨。要把 RIM 做成真正的三维体积成像，作者指出关键在于：记录低分辨三维栈时，样品相对散斑照明不能移动，否则成像模型不再是三维卷积，后续的全局三维处理就无法成立。

方法：远程聚焦 + 3D Wiener + 3DalgoRIM

图1．3D-RIM 在单细胞层面的示意与结果。a：散斑照明样品；探测臂用电调焦透镜（electrically tunable lens, ETL）做远程聚焦，在照明不变的前提下采集 z 栈；对约 100–200 组三维散斑图像做方差匹配重建。b：活体肺炎链球菌 FtsZ:GFP 分裂环的 xz 切面，3D-RIM 相对反卷积宽场可更好显示环孔（环总直径可至约 230 nm）。c：固定 Hep3B 细胞核 DNA（样品厚约 15 µm），3D-RIM 相对反卷积宽场对比度更高；深度编码最大强度投影；作者用傅里叶环相关（Fourier ring correlation, FRC）估计横向约 110 nm、轴向约 270 nm。
来源：原文 Figure 1；Mangeat et al., bioRxiv 2025；https://doi.org/10.1101/2025.08.06.668879（CC BY-NC-ND 4.0）

硬件与采集要点：

1. 平台：标准 Nikon TiE 倒置荧光显微镜；空间光调制器（SLM）产生散斑；相机为 Teledyne Kinetix；同步与采集由商业 Inscoper L 电子/软件系统完成。

2. 远程聚焦：在探测 4f 系统傅里叶面放置 ETL，轴向扫描时样品相对照明图案不动，从而满足三维卷积模型。

3. 采集顺序：同一焦面先采完 P 张散斑，再换 z；固定样 P≈200，活体 P≈100；单平面曝光约 10 ms；z 步长依样品在约 90–250 nm。

4. 重建（3DalgoRIM）：先对原始三维图像做三维 Wiener 滤波（把焦外光子“重分配”回源点，放大散斑热点、抬高方差信噪比），再迭代匹配经验标准差与理论模型，并加 Tikhonov 正则；正则参数 ε、µ 需手动调节。作者用点扩散函数生成器（Gibson–Lanni 模型）估计显微镜点扩散函数 h 与散斑自相关 Γ；理论标准差计算借助算子谱截断（实践中前约十项通常足够）。对比用的“常规 RIM / 2D-RIM”则是把各平面独立按二维处理后再堆叠。

主要结果

1. 薄样品：可与 3D-SIM 相比的分辨

在活体细菌 FtsZ 环与固定人细胞染色体上，3D-RIM 轴向切面与对比度明显优于反卷积宽场；当分裂环整体直径收缩到约 230 nm 时，环内孔仍可被提示。对约 15 µm 厚的 Hep3B DNA 样品，FRC 给出约 110 nm（横向）/ 270 nm（轴向）。作者据此认为，在薄样品上 3D-RIM 可达到与 3D-SIM 相当的分辨水平。

2. 厚组织：果蝇胚胎与小鼠肠——背景更干净、轴向更好

图2．厚组织成像。a、b：果蝇胚胎 lamin 免疫染色（核被膜）；成像深度约 27–52 µm；a 为距盖玻片约 40 µm 的大视场 xy 切面及深度编码投影；FRC 约 180 nm / 450 nm。b：同一区域 xz，3D-RIM 相对逐层 2D-RIM 堆叠对比度更高、轴向线轮廓更锐。c、d：小鼠肠 Paneth 细胞 WGA–罗丹明标记分泌颗粒膜，深度约 27–42 µm；FRC 约 230 nm / 470 nm；密集标记下 2D-RIM 受焦外噪声拖累，3D-RIM 可勾勒单个颗粒外形。
来源：原文 Figure 2（CC BY-NC-ND 4.0）

相对“逐层做 2D-RIM 再堆栈”，全局三维处理利用了焦外光子信息与三维点扩散函数、散斑统计，光学切片与去背景更有效。肠组织因分泌颗粒密集、隐窝几何复杂，散射与像差更强，也更能体现三维方差重建相对平面堆叠的优势。

3. 胶原支架中的树突细胞：深至约 450 µm 仍有对比

图S1．小鼠骨髓来源树突细胞在胶原凝胶中迁移后的 α-tubulin 免疫荧光；最大强度投影，深度约 40、150、450 µm。作者报告横向分辨约 330 nm；轴向由约 750 nm（40 µm）至约 1 µm（150 与 450 µm）。同一切面相对宽场及反卷积宽场，3D-RIM 背景更低；反卷积宽场横向约 660 nm。
来源：原文 Supplementary Figure S1（CC BY-NC-ND 4.0）

4. 活体：果蝇卵室 border cells 约 30 min、深至约 65 µm

固定卵室（约 33–46 µm）中，border cells 簇内单根肌动蛋白纤维束可被分辨；活体卵室中，作者追踪 border cells 迁移末期的 actin 动态突起，全过程约 30 分钟、深度可达约 65 µm，体积图像间隔约 3 分钟，作者报告无明显漂白与光毒性迹象（补充图 S2 及视频 7–9）。这说明在作者所选标记与曝光条件下，三维散斑采集与 3DalgoRIM 重建可以用于数十微米深处活体样品的体积时序观察。需要注意，作者展示的活体时序为 8 个体积图像、相邻间隔约 3 分钟（活体标记为 slbo::LifeAct–RFP，激发波长 561 nm，物镜数值孔径 1.3，每个焦面采集 100 张散斑图像，z 步长 250 nm）。这是我们的推断：该数据反映的是分钟级的组织迁移过程，并非秒级的快速动态。

5. 补充：各样品的成像条件

作者使用四条激光（405、488、561、633 nm）激发；物镜依样品分别为 60× 硅油物镜（数值孔径 1.3，用于 Hep3B 细胞、果蝇胚胎、小鼠肠 Paneth 细胞与果蝇卵室 border cells）、100× 油浸物镜（数值孔径 1.49，用于 FtsZ 环）以及 40× 水浸物镜（数值孔径 1.15，用于胶原凝胶中的树突细胞）。重建中，正则参数 ε 在 5×10⁻⁴ 至 2×10⁻³ 之间、µ 在 1.6×10⁻⁷ 至 6×10⁻⁶ 之间，迭代 50–100 次收敛。作者特别指出，重建仅使用标准 Tikhonov 正则。

结论与意义

作者的结论是：3D-RIM 将全局三维数据处理的效率，与 RIM 对激发侧像差的鲁棒性、较低光毒性及在活体样品上的易用性结合起来，可为厚生物样品提供对比度良好的超分辨体积图像，并为在发育中的胚胎、类器官等完整组织内研究亚细胞结构与动态提供新的可能。

这是我们的推断：本文最关键的工程要点在于“样品相对散斑照明不动”这一前提——轴向扫描改由探测臂远程聚焦完成，三维卷积成像模型才得以成立，焦外光子也由此从“背景”转化为可用于三维光子重分配的信息。这一思路与逐层二维处理后再堆叠的做法有本质区别，图2 中两者的对比即体现了这一点。

与 INSCOPER liveDRIM 的关系

原文方法部分记载，3D-RIM 实验中的同步与采集由商业 Inscoper L 电子/软件系统完成。而散斑生成所用的空间光调制器、远程聚焦单元（4f 中继透镜与 Optotune 电调焦透镜）以及 3DalgoRIM 重建算法，在原文中均作为作者团队的学术实现进行描述；原文并未说明这些部分已纳入商业 liveDRIM 系统。因此，本文所述的三维体积成像能力应理解为 RIM 方法路径上的学术进展；liveDRIM 系统当前实际提供的功能、配置与指标，应以 INSCOPER 正式产品资料为准。

局限与注意事项

1. 预印本未经同行评审：当前为 bioRxiv v2，作者注明该版本补充了 Xiangyi Li 在 3D-RIM 重建方法上的算法改进；后续版本或正式发表时内容可能变化。

2. 分辨率数值依赖具体样品与条件：文中分辨率多由傅里叶环相关估计，胶原凝胶中树突细胞的数值则依据最细纤维的半高全宽估计；这些数值对应特定样品、物镜与标记，不宜直接视为系统规格。另外，原文正文称 FtsZ 环整体直径接近 300 nm 时仍可见中央孔，而图1 图注所述为 230 nm，两处表述不一致。

3. 深度与活体需区分：约 450 µm 深度的数据来自固定的树突细胞样品；活体数据中报告的最大深度约为 65 µm。

4. 采集量与参数调节：每个焦面需采集 100–200 张散斑图像，这是我们的推断：体积成像的时间分辨率会因此受限（作者亦指出，变换焦面是时序采集中的限制因素）；正则参数 ε、µ 需依原始图像信噪比手动调节。

5. 方法属性：本文为学术方法研究，不是商业 liveDRIM 系统的评测；仅 INSCOPER 实际提供的部分可作为产品能力介绍。

原文信息

Super-resolved live imaging of thick biological samples with 3D Random Illumination Microscopy (3D-RIM)

• 作者：Thomas Mangeat, Lorry Mazzella, Benoît Rogez, Guillaume Giroussens, Xiangyi Li, Mathilde Bernard, Pablo Vargas, Marc Allain, Simon Labouesse, Jérôme Idier, Loïc LeGoff, Anne Sentenac

• 平台：bioRxiv preprint；当前版本 v2（约 2025-09-16 posted）

• DOI：https://doi.org/10.1101/2025.08.06.668879

• 全文：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.08.06.668879v2.full

• 许可：CC BY-NC-ND 4.0

本文为对原文的解读，非作者官方译文。预印本内容可能更新。

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